昀冠新闻
分析方法验证中耐用性验证的剖析
Fri Mar 17 00:00:00 CST 2023昀冠科学商城新闻编辑
对于开发出来的分析方法，需要对其进行全面的验证，其中耐用性的验证非常重要，分析方法的耐用性，是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，是为了考察方法本身对于可变试验因素的抗干扰能力，对于微小变化的理解，千人千面，到底多少算微调，多少算大的调整，对于液相色谱法中，本人对以下变动因素进行举例解析：
一：色谱柱的选择
在做色谱柱耐用性选择时，需要选择不同品牌，不同批号的色谱柱，至少筛选3个不同厂家生产的色谱柱，并且需要保证不同厂家的色谱柱系统适用性应符合要求，色谱峰出峰顺序不变，目的一是为使用方便，采购方便，并且采购部门在价格上也有主动权，另一个方面有的色谱柱厂家可能某一款色谱柱停产不生产了，或者更新换代后，不一定适用样品的检测，因此色谱柱的选择是非常关键的一项。
对于不同的检测项目，还要具体分析，譬如，对于有关物质的检测，往往要求几个杂质甚至十几个杂质的分离，因此为了保险起见，我一般选择比较知名厂家知名品牌的色谱柱，虽然价格上会贵一些，但是质量上会更有保障一些，对于含量和溶出的检测，色谱柱的使用频次较多，检测量较大，色谱柱在这里就属于易耗品，在有些项目要求不是太严格，譬如只要主峰塔板数能满足要求，重复性符合规定的情况下，我一般选择便宜且易获得的色谱柱，但是同样也是需要选择至少3个厂家的色谱柱。
二：流动相比例的验证
首先，在反向色谱法中，流动相比例的调整，往往对样品的检测影响较大，流动相中有机相的比例较大，在其他条件保持不变的情况下，主峰出峰时间靠前，水相的比例较大时，出峰时间往往靠后，是因为反相色谱中，色谱柱的填料是非极性的，而流动相是极性的，根据相似相容原理，当流动相有机相比例提高后，即降低了流动相的极性，流动相的洗脱能力得到提高。所以样品出峰会靠前。
在做含量和溶出的方法验证时，流动相比例变化±5%，只要主峰的拖尾因子和理论塔板数能符合要求，一般对样品的检测结果影响不太明显（含量的结果的变化量≤2.0%），如果不满足要求，将流动相的比例变化收紧到±2%，继续进行测试。
例如：甲钴胺含量的检测
从结果来看，流动相中有机相的比例变化±5%，系统适用性中，对照品溶液的塔板数均大于3000，含量的变化量均小于2.0%。耐用性良好。
但是对于有关物质的研究，流动相比例变化±5%，影响非常大，是因为有关物质的研究，需要关注的杂质往往有几个甚至十几个，在同一个体系下既要使各个杂质能有效分离，流动相中比例的变动可能导致某个杂质和相邻的杂质不能有效分离。那么，我们在方法验证中，怎么调整流动相的比例呢，我的做法是一般在保证一相不变的情况下，调整另一相。
举个例子：维格列汀有关物质的检测
流动相A又是一个比较复杂的比例，水相中既有磷酸盐缓冲液又有水相、有机相中既有乙腈又有甲醇，那么我们现在有如下4个设计方案，把水相看做一个整体，有机相看做一个整体。将有机相的比例调整。
这样既考虑了在流动相有微小变动的情况下，系统适用性溶液中各个杂质都能有效分离，也能保证供试品溶液中各个杂质的检出量均小于10%，能起到验证方法的目的。
但是，假如某个验证的条件试验结果数据超过要求的限度范围内，则需要对该条件进行严格控制。
三：柱温和流速耐用性范围的考察
液相虽然经过校正，但允许存在一定的误差，柱温允许±1℃~2 ℃等，仪器流速误差小，但仍然进行有±10%~20%的变动耐用性考察，因此，柱温和流速的耐用性不需要考察太大的范围内，柱温一般验证范围为±5℃，流速一般±0.2ml/min，但是如果在验证的过程中，发现结果不符合可接受标准，则需将柱温范围收紧到±2℃，流速的范围收紧到±0.1ml/min继续进行验证，如果还不能符合可接受标准，则需对检测方法进行严控，并在质量标准中进行说明。
四：检测波长的耐用性考察
需要分2个方面来讲，含量和溶出的耐用性考察和柱温流速一样，不需要太大的范围，一般±5nm就行，这里需要重点说明的是，有关物质的耐用性考察，有关物质中，各个杂质的响应值不同，有的甚至差别很大，假如检测波长耐用性范围调整的过大譬如±10nm或者±5nm，会导致检测结果差别较大，特别是一些杂质需要加校正因子，结果差别更大，就失去了验证的意义，因此，有关物质的波长的耐用性调整为±2nm就可以了。
这样，通过全套的耐用性的考察，将检测方法确定下来，在正常的样品检测下，在耐用性变动参数范围内改变参数均不算改变方法，达到了方法验证的目的。
参考文献：
［1］2020年版《中国药典》四部分析方法验证指导原则（9101）
［2］《药品GMP指南》（2010年修订）
［3］欧洲药典质量标准的起草技术指南
